原理

Trizol 是一種新型總 RNA 抽提試劑，采用變性劑即內(nèi)含異硫氰酸胍酚和 β-巰基乙醇等變性物質(zhì)，能迅速破碎細(xì)胞，抑制細(xì)胞釋放出的核酸酶。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)，并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇主要破壞 RNase 蛋白質(zhì)中的二硫鍵。細(xì)胞裂解后，細(xì)胞釋放出蛋白質(zhì)、DNA、RNA 等物質(zhì)，再根據(jù)它們在不同的 PH 值和不同極性溶劑的溶解度不同而使得分開。

材料與儀器

儀器：細(xì)胞樣品、TRIzol 試劑、氯仿、異丙醇、75% 乙醇、DEPC、H2O
材料：離心管、離心機(jī)、EP 管、勻漿器、移液管、冰袋、漩渦振蕩器

步驟

1. 樣品處理：

（1） 培養(yǎng)細(xì)胞：收獲細(xì)胞 1~5 × 107，移入 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL Trizol，混勻，室溫靜置 5 min。

（2） 組織：取 50~100 mg 組織（新鮮或 -70 ℃ 及液氮中保存的組織均可）置 1.5 mL 離心管中，加入 1 mL Trizol 充分勻漿，室溫靜置 5 min。

2. 加入 0.2 mL 氯仿，振蕩 15 s，靜置 2 min。

3. 4 ℃ 離心，12000 g × 15 min，取上清。

4. 加入 0.5 mL 異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置 10 min。

5. 4 ℃ 離心，12000 g × 10 min，棄上清。

6. 加入 1 mL 75% 乙醇，輕輕洗滌沉淀。4 ℃，7500 g × 5 min，棄上清。

7. 晾干，加入適量的 DEPC H2O 溶解（65 ℃ 促溶 10~15 min）

注意事項(xiàng)

1. 樣品量和 Trizol 的加入量一定要按步驟（1）的比例，不能隨意增加樣品量或減少 Trizol 量，否則會使內(nèi)源性 RNase 的抑制不wan全，導(dǎo)致 RNA 降解。

2. 實(shí)驗(yàn)過程必須嚴(yán)格防止 RNsae 的污染。

常見問題

1. RNA 的定量計(jì)算：

RNA 定量方法與 DNA 定量相似，RNA 在 260 nm 波長處有最大的吸收峰。因此，可以用 260 nm 波長分光測定 RNA 濃度，OD 值為 1 相當(dāng)于大約 40 μg/mL 的單鏈 RNA。如用 1 cm 光徑，用 ddH2O 稀釋 DNA 樣品 n 倍并以 ddH2O 為空白對照，根據(jù)此時(shí)讀出的 OD260 值即可計(jì)算出樣品稀釋前的濃度：RNA（mg/mL） = 40 × OD260 讀數(shù) × 稀釋倍數(shù)（n） / 1000。

2. RNA 的純度：
RNA 純品的 OD260/OD280 的比值為 2.0，故根據(jù) OD260/OD280 的比值可以估計(jì) RNA 的純度。

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