慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)

慢病毒（Lentivirus）載體是以 HIV-1 （人類免疫缺陷 1 型病毒）為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。慢病毒具有感染譜廣泛、可以有效感染分裂期和靜止期細(xì)胞、長期穩(wěn)定表達(dá)外源基因等優(yōu)點(diǎn)，因此成為導(dǎo)入外源基因的有力工具?，F(xiàn)在慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過表達(dá)、RNA 干擾、microRNA 研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中。

一、實(shí)驗(yàn)流程

圖  1、 慢病毒包裝實(shí)驗(yàn)流程圖

二、實(shí)驗(yàn)儀器與實(shí)驗(yàn)材料

psPAX2 質(zhì)粒，pMD2.G 質(zhì)粒，pHBLVTM 系列質(zhì)粒；293T 細(xì)胞；wan全培養(yǎng)基；DH5α 菌株；Stbl3 菌株。

三、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 質(zhì)粒擴(kuò)增。將構(gòu)建好的慢病毒載體和包裝質(zhì)粒使用大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的去內(nèi)毒素抽提，濃度建議不低于 1 μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 間方可用于病毒包裝。推薦使用 Qiagen 大抽試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒的大量去內(nèi)毒素抽提（質(zhì)粒質(zhì)量會(huì)極大影響后續(xù)轉(zhuǎn)染效率和病毒的滴度）。

2. 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前一天，在10 cm皿中接種生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，以第二天匯合度能達(dá)到 30% ~ 50% 為宜。24 h 后轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染前需要把 DMEM 和慢病毒包裝專用轉(zhuǎn)染試劑 LentiFitTM 恢復(fù)至室溫，使用前需搖勻。每個(gè)皿的質(zhì)粒成分如下：

表 1、慢病毒包裝轉(zhuǎn)染體系

用于包裝的三個(gè)質(zhì)粒摩爾比通常為 1:1:1，可以根據(jù)情況稍加調(diào)整。請參考 LentiFitTM 轉(zhuǎn)染試劑說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染操作，轉(zhuǎn)染后 4-6 h 換新鮮培養(yǎng)基。

3. 病毒收集和離心。轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 分別兩次收集病毒上清（48 h 收集后置換新鮮培液）， 將收集的上清用 0.45 μm 濾器過濾，然后放于超速離心管中，4 ℃，72000 g 離心 120 min。

4. 病毒重懸和保存。棄上清，500 μl 重懸液重懸病毒沉淀，一周內(nèi)使用則置于 4 ℃ 保存，如需長時(shí)間存放需置于 -80 ℃ 或液氮罐保存。（注：具體重懸體積根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求而定）

5. 滴度測定。在 96 孔板中鋪合適數(shù)量的 293T 細(xì)胞，第二天將慢病毒原液進(jìn)行梯度稀釋后分別感染 293T 細(xì)胞，感染 24 h 后換成無病毒的培養(yǎng)液，感染 72 h 后在熒光顯微鏡下觀察結(jié)果，對熒光比例合適（10 ~ 30% 之間）的孔進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

滴度計(jì)算公式為：滴度（TU/ml）=細(xì)胞數(shù) ×熒光百分比×10 3 / 病毒原液體積

四、注意事項(xiàng)

1. 慢病毒相關(guān)實(shí)驗(yàn)請?jiān)谏锇踩瘢?/span>BL-2 級(jí)別）內(nèi)操作。

2. 操作病毒時(shí)請穿實(shí)驗(yàn)服，佩戴口罩和手套，盡量不要裸露雙手及手臂的皮膚。

3. 操作病毒時(shí)特別小心病毒濺出。如果操作時(shí)超凈工作臺(tái)有bing毒污染，請立即用 70% 乙醇加 1% 的 SDS 溶液擦拭干凈。接觸過病毒的槍頭、離心管、培養(yǎng)板、培養(yǎng)液請于 84 消毒液浸泡后統(tǒng)一處理。

4. 如需要離心，應(yīng)使用密封性好的離心管， 如有必要請用封口膜封口后離心。

5. 病毒相關(guān)的廢棄物需要特殊收集，統(tǒng)一經(jīng)高溫滅菌處理。

6. 實(shí)驗(yàn)完畢用香皂清洗雙手。

五、常見問題

1. 影響慢病毒出毒及滴度的原因有哪些？

（1）質(zhì)粒。包毒前需要對包裝及表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行去內(nèi)毒素處理，濃度建議不低于 1μg/μl，A260/280 在 1.7-1.8 間；

（2）轉(zhuǎn)染試劑和質(zhì)粒比例。要用轉(zhuǎn)染效率高，細(xì)胞毒性小的轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染時(shí)質(zhì)粒間比例得當(dāng)，建議三質(zhì)粒包裝系統(tǒng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染時(shí)的摩爾比為 1:1:1 可根據(jù)目的基因大小進(jìn)行調(diào)整；

（3）目的基因。一般慢病毒包裝的目的片段大小在 3 k 以內(nèi)較為合適，大于 3 k 會(huì)降低滴度或超過載體容量無法包裝、目的基因本身是否具有毒性也會(huì)影響慢病毒的出毒效率；

（4）包裝細(xì)胞 -293T 細(xì)胞的狀態(tài)。細(xì)胞出毒過程中的細(xì)胞活力是包裝成功及病毒滴度高低的一個(gè)重要環(huán)節(jié)，進(jìn)行包裝轉(zhuǎn)染 293T 細(xì)胞前一定要重視細(xì)胞是否干凈、飽滿立體感是否好、鋪板是否均勻，細(xì)胞密度在 50-60% 時(shí)進(jìn)行包裝比較合適；

（5）病毒收集：在 24、48 h 觀察細(xì)胞及熒光狀態(tài)，判斷是否正常，轉(zhuǎn)染后 48 h 和 72 h 分別兩次收集病毒上清（48 h 收集后置換新鮮培液）。

2. 該如何選擇合適的慢病毒包裝質(zhì)粒？

慢病毒常用的包裝系統(tǒng)是二代三質(zhì)粒系統(tǒng)，骨架質(zhì)粒 pSPAX2 和包膜質(zhì)粒 pMD2.G 是明確的包裝質(zhì)粒。目的基因的表達(dá)質(zhì)粒需要根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，主要包括啟動(dòng)子、標(biāo)簽蛋白、熒光和抗性等元件。

（1）目的基因的過表達(dá)通常選擇 CMV/EF1a 啟動(dòng)子，目的基因的干擾通常選擇U6 啟動(dòng)子；

（2）若需要穩(wěn)轉(zhuǎn)株篩選，則需攜帶 PURO/BSD/NEO 等抗性篩選基因；

（3）后續(xù)需要觀察慢病毒感染效率一般需要攜帶 EGFP/mCherry 等熒光蛋白便于通過顯微鏡直觀監(jiān)測感染效率；

（4）標(biāo)簽蛋白的選擇可以根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，如純化蛋白常使用 His 標(biāo)簽，CO-IP 常使用 Flag/HA/Myc 標(biāo)簽，PULLDOWN 常使用 GST 標(biāo)簽等。