一個成功的IHC實驗，以下七個環(huán)節(jié)至關(guān)重要，如同一個精密的鏈條，缺一不可。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點一：樣本制備 - 基石

組織固定：

要點： 及時、充分、適度。離體組織應(yīng)盡快（通常30分鐘內(nèi)）放入足量（10-20倍體積）的10%中性福爾馬林緩沖液中。

目的： 保存抗原性，防止降解和彌散。固定不足會導(dǎo)致抗原丟失；固定過度會遮蔽抗原表位，導(dǎo)致后續(xù)抗原修復(fù)困難。

石蠟包埋與切片：

要點： 組織脫水、透明、浸蠟過程要ce底但不過度。切片厚度通常為3-5μm，要求平整、無褶皺、無裂痕。

目的： 獲得高質(zhì)量的組織切片，為后續(xù)染色提供基礎(chǔ)。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點二：抗原修復(fù) - 關(guān)鍵步驟

為什么需要： 福爾馬林固定會使蛋白質(zhì)交聯(lián)，遮蔽抗原表位?？乖迯?fù)的目的是打破這些交聯(lián)，使抗原重新暴露。

主要方法：

熱誘導(dǎo)表位修復(fù)（HIER）： zui常用。使用檸檬酸鹽（pH 6.0）或EDTA/EGTA（pH 8.0-9.0）緩沖液，在微波爐、高壓鍋或水浴鍋中加熱。pH值的選擇對某些抗體至關(guān)重要。

酶消化修復(fù)： 使用胰蛋白酶、胃蛋白酶等。適用于部分固定過度或特定抗原。

要點： 根據(jù)目標(biāo)抗原和一抗說明書，優(yōu)化修復(fù)方法和pH值。修復(fù)后需自然冷卻，避免驟冷。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點三： 內(nèi)源性過氧化物酶阻斷

要點： 在加入一抗前，用3% H?O?溶液處理切片，孵育10-15分鐘。

目的： 阻斷組織內(nèi)源性的過氧化物酶（尤其在紅細(xì)胞、粒細(xì)胞中），防止在后續(xù)DAB顯色時產(chǎn)生非特異性背景著色。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點四：封閉

要點： 使用與二抗來源同種的正常血清（如，二抗是山羊抗兔，則用正常山羊血清）或BSA（牛血清白蛋白），室溫封閉20-30分鐘。

目的： 封閉組織切片上非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，減少一抗、二抗的非特異性吸附，降低背景。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點五：抗體孵育- 核心反應(yīng)

一抗孵育：

要點： 抗體濃度、孵育時間和溫度是三大關(guān)鍵變量。必須參照說明書并進(jìn)行預(yù)實驗優(yōu)化。孵育通常在4°C過夜（特異性好）或室溫1-2小時（快速）。

目的： 特異性識別并結(jié)合目標(biāo)抗原。

二抗孵育：

要點： 二抗需與一抗的種屬和亞型匹配。通常室溫孵育30-60分鐘。

目的： 攜帶標(biāo)記物（如酶HRP或熒光基團(tuán)）與一抗結(jié)合，起放大信號的作用。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點六：顯色

要點： zui常用的是DAB（二氨基聯(lián)苯胺） 顯色。DAB在HRP催化下產(chǎn)生棕褐色不溶性沉淀。

關(guān)鍵： 鏡下控制顯色時間！ 通常在顯微鏡下觀察，待特異性信號清晰而背景未著色時立即終止反應(yīng)（一般幾十秒到幾分鐘）。時間過短則信號弱，過長則背景深。

其他： AEC（紅色）等，但產(chǎn)物溶于有機(jī)溶劑，需水性封片劑封片。

免疫組化（IHC）核心技術(shù)要點七：復(fù)染、脫水、封片

復(fù)染： 常用蘇木精（Hematoxylin） 對細(xì)胞核進(jìn)行藍(lán)色復(fù)染，提供組織形態(tài)學(xué)對照。

脫水透明： 經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明，使組織透亮。

封片： 使用中性樹膠封片，長期保存。

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