繼推出《細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中如何避免內(nèi)毒素的不良影響》《細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)方法》后，有沒(méi)有小伙伴想知道細(xì)菌內(nèi)毒素如何去除呢？今天讓我們一起答疑解惑！

前言：19世紀(jì)，Ernstvon Bergmann提出了毒素的概念，他認(rèn)為腐爛的液體含有一種水溶性但不溶于酒精、耐熱、不揮發(fā)的物質(zhì)，這種物質(zhì)會(huì)引起疾病癥狀。20世紀(jì)初，Pfeie等學(xué)者提出了內(nèi)毒素的名稱，確定了整個(gè)細(xì)菌家族擁有基本相同的毒素，并發(fā)現(xiàn)了內(nèi)毒素的熱原性和毒性之間的密切關(guān)系。20世紀(jì)中葉，Lüderitz 和Westphal等學(xué)者從患者血清中分離出內(nèi)毒素，而將多糖和脂質(zhì)等非蛋白質(zhì)的部分命名為脂多糖(LPS)。此后對(duì)內(nèi)毒素脂多糖的化學(xué)表征發(fā)展迅速，相繼開(kāi)展內(nèi)毒素脂多糖的核心多糖、空間結(jié)構(gòu)、衍生物、類似物的化學(xué)合成和生物分析。細(xì)菌內(nèi)毒素結(jié)構(gòu)分為三個(gè)部分: 類脂A(Lipid A)、核心多糖(Corepolysaccharide)和一系列重復(fù)的氧多糖側(cè)鏈(O-polysaccharide side chain)。

 細(xì)菌內(nèi)毒素如何去除？

細(xì)菌內(nèi)毒素，特別是脂多糖(LPS)，是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的一種成分，對(duì)生物制品，尤其是基于大腸桿菌表達(dá)的病毒樣顆粒(VLP)疫苗的生產(chǎn)構(gòu)成了重大挑戰(zhàn)。內(nèi)毒素的復(fù)雜結(jié)構(gòu)和穩(wěn)定性使其難以通過(guò)常規(guī)純化技術(shù)去除，且其生物活性強(qiáng)，即使是微量殘留也可能對(duì)疫苗的安全性和有效性構(gòu)成威脅。同時(shí)，內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì)，其熱穩(wěn)定性使得它即使在100℃的高溫下加熱1小時(shí)也不會(huì)被破壞。在更高的溫度(如115℃)下濕熱處理30分鐘，也只能破壞大約25%的熱原質(zhì)。為了ce di破壞內(nèi)毒素的生物活性，需要采用更高的溫度和更長(zhǎng)的處理時(shí)間，如180℃下干烤3-4小時(shí)或250℃下干烤1-2小時(shí)。此外，強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸30分鐘才能有效破壞內(nèi)毒素。以下介紹幾種比較常見(jiàn)的去除細(xì)菌內(nèi)毒素的方法。

1. 膜過(guò)濾法

膜過(guò)濾法是一種物理去除內(nèi)毒素的方法。由于內(nèi)毒素分子相對(duì)較大，通過(guò)選擇合適的膜孔徑和操作條件，可以實(shí)現(xiàn)內(nèi)毒素的有效截留。然而，這種方法需要特別注意膜的選擇和操作參數(shù)的優(yōu)化，以避免對(duì)目標(biāo)蛋白或VLP造成損失。

2. 親和層析法

親和層析法利用特定的層析介質(zhì)對(duì)內(nèi)毒素的親和性進(jìn)行去除。通過(guò)優(yōu)化層析條件，如pH值和離子強(qiáng)度，可以進(jìn)一步提高去除效率和降低蛋白損失。這種方法具有高效、選擇性好的優(yōu)點(diǎn)，但需要針對(duì)具體的生物制品進(jìn)行優(yōu)化。特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運(yùn)用使得生物大分子的純化變得簡(jiǎn)單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用，以目標(biāo)蛋白作為抗原，將通過(guò)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上，此介質(zhì)來(lái)吸附目標(biāo)蛋白。由于相互作用的高度特異性，理論上僅有目標(biāo)蛋白吸附于介質(zhì)上，內(nèi)毒素全部穿透，洗脫后將得到純度很高的無(wú)熱原產(chǎn)品。

實(shí)際上，由于介質(zhì)本身存在的非特異性吸附，仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)被吸附，但內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產(chǎn)中，洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25EU/mL。

3. 密度梯度超離心法

密度梯度超離心法依據(jù)內(nèi)毒素與其他溶液組分在密度、沉降系數(shù)等方面的差異進(jìn)行分離。然而，由于內(nèi)毒素的存在形式多樣，這種方法的應(yīng)用受到一定限制，且操作復(fù)雜，成本較高。

4. 活性炭吸附法

活性炭吸附法適用于小分子溶液或水中的內(nèi)毒素去除。然而，它對(duì)有效成分也有吸附作用，且殘留的活性炭不易去除，因此在實(shí)際應(yīng)用中需要謹(jǐn)慎考慮。

5. 分子篩法(凝膠過(guò)濾層析)

分子篩法利用凝膠分子篩的空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行過(guò)濾層析，適用于蛋白分子量較小的溶液。這種方法操作簡(jiǎn)便，但對(duì)內(nèi)毒素的去除效率可能不如其他方法高。

內(nèi)毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為1000kDa分子聚集體，它與多數(shù)生物蛋白分子量差異較大，基于這一特征，可以采用凝膠過(guò)濾層析，將大分子內(nèi)毒素分子與目標(biāo)蛋白分離。但其處理量小, 處理時(shí)間較長(zhǎng)。

6. 化學(xué)處理法

化學(xué)處理法通過(guò)使用特定的化學(xué)物質(zhì)，如Triton X-114進(jìn)行兩相分離，可以有效去除LPS。然而，這些化學(xué)物質(zhì)可能會(huì)對(duì)VLP的結(jié)構(gòu)造成損害，因此需要在使用前進(jìn)行充分的評(píng)估和優(yōu)化。

7. 離子交換層析法

LPS帶有負(fù)電荷，因此可以通過(guò)離子交換層析法進(jìn)行去除。這種方法操作簡(jiǎn)便，且對(duì)目標(biāo)蛋白的損失較小。然而，需要針對(duì)具體的生物制品選擇合適的離子交換介質(zhì)和操作條件。

對(duì)于陰離子交換層析，內(nèi)毒素在pH>2時(shí)帶負(fù)電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE有較強(qiáng)結(jié)合, 可使用目標(biāo)蛋白從陰離子交換填料流穿的方式去除內(nèi)毒素；也可在目標(biāo)蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)結(jié)合于層析介質(zhì)上后，由于內(nèi)毒素的結(jié)合能力較蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)，因此可先將目標(biāo)蛋白洗脫出來(lái)，然后再用高鹽緩沖液或NaOH將內(nèi)毒素洗出。

對(duì)于陽(yáng)離子交換層析，在pH4.0時(shí)，內(nèi)毒素還是帶有負(fù)電荷不能和填料結(jié)合而隨流動(dòng)相流出層析柱，目標(biāo)蛋白則可以與陽(yáng)離子交換介質(zhì)結(jié)合，因此采用陽(yáng)離子交換層析也可以很好的去除內(nèi)毒素。此外，采用一些表面活性劑比如Triton X-114，既能阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陰離子柱上也可阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陽(yáng)離子柱上。

8. 聚合物沉淀法

這種方法主要依賴于特定的聚合物，如聚乙二醇(PEG)，來(lái)沉淀出內(nèi)毒素(如LPS)。這種方法操作簡(jiǎn)便，意味著它不需要復(fù)雜的設(shè)備或高深的技術(shù)知識(shí)。然而，要實(shí)現(xiàn)最佳效果，必須嚴(yán)格控制聚合物的濃度和操作條件。這是因?yàn)檫^(guò)高的濃度或不當(dāng)?shù)牟僮鳁l件可能會(huì)對(duì)目標(biāo)蛋白造成損失，從而影響最終產(chǎn)品的質(zhì)量和純度。

9. 遺傳工程改造法

近年來(lái)，通過(guò)遺傳工程改造大腸桿菌菌株，使其內(nèi)毒素生物合成途徑發(fā)生變化，從而產(chǎn)生脂質(zhì)IVA而非完整的內(nèi)毒分子，成為了一種新的去除內(nèi)毒素的方法。脂質(zhì)IVA是內(nèi)毒素的前體，不會(huì)觸發(fā)人類典型的內(nèi)毒素反應(yīng)，因此是生產(chǎn)治療性蛋白的更安全選項(xiàng)。這種方法為生物制品的生產(chǎn)帶來(lái)了重大進(jìn)步，因?yàn)樗赡芟吮磉_(dá)后進(jìn)行昂貴且效率低下的內(nèi)毒素去除過(guò)程的需求。

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