你知道什么是Sanger雙脫氧鏈終止法嗎？讓我們一起來(lái)看看吧！

一、原理

Sanger雙脫氧鏈終止法是第一代測(cè)序技術(shù)中最為經(jīng)典的一種。其巧妙的利用DNA復(fù)制原理,利用ddNTP來(lái)部分代替常規(guī)的dNTP作為底物進(jìn)行DNA合成反應(yīng)。在DNA合成時(shí),一旦ddNTP參入到合成DNA鏈中,由于ddNTP脫氧核糖的3’-位碳原子上缺少羥基，而不能與下一位核苷酸的5’-位磷酸基之間形成3’,5’-磷酸二酯鍵，從而使得正在延伸的DNA鏈在此ddNTP處終止。

二、實(shí)驗(yàn)步驟

1. 將待測(cè)序測(cè)序的DNA片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到充足的DNA模版用于進(jìn)行測(cè)序。

得到的DNA模板需要進(jìn)行純化，需要確保去除所有雜質(zhì)，包括DNA片段、蛋白質(zhì)、RNA等。

2. 根據(jù)待測(cè)序列的特點(diǎn)與實(shí)驗(yàn)要求，設(shè)計(jì)一些特定的引物。

一般來(lái)說(shuō)，通用引物的長(zhǎng)度以15～30bp為宜。

3. 合成標(biāo)記物。標(biāo)記物是指示測(cè)序反應(yīng)是否成功的物質(zhì)，通常是一種熒光染料或放射性同位素。

4. 將DNA模板、引物、DNA聚合酶和標(biāo)記物等物質(zhì)混合在一起，進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)。

在反應(yīng)過(guò)程中，DNA聚合酶將根據(jù)DNA模板中的堿基序列合成新的DNA鏈，同時(shí)將標(biāo)記物結(jié)合到新合成的DNA鏈中。

5. 將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離，根據(jù)標(biāo)記物的不同熒光信號(hào)或放射性同位素的存在，確定DNA序列中的堿基排列順序。

在Sanger測(cè)序法的基礎(chǔ)上，將熒光信號(hào)接收器和計(jì)算機(jī)信號(hào)分析系統(tǒng)替代放射自顯影技術(shù)，使用熒光素標(biāo)記替代32P或35S單一放射性核素標(biāo)記，打開(kāi)了DNA測(cè)序技術(shù)自動(dòng)化的大門(mén)。

三、Sanger測(cè)序法的優(yōu)缺點(diǎn)

優(yōu)點(diǎn)：

1. Sanger是直接對(duì)DNA分子進(jìn)行測(cè)序，適用于已知序列的驗(yàn)證測(cè)序、文庫(kù)篩選、克隆鑒定、pcr重測(cè)序等。

2. 其zui大優(yōu)點(diǎn)在于讀取速度很高、高精確度，而且成本相對(duì)很低。相較于化學(xué)降解測(cè)序法，對(duì)于富含G-C的區(qū)域也不會(huì)影響測(cè)序效果。

缺點(diǎn)：

1. 必須有已經(jīng)序列設(shè)計(jì)測(cè)序引物，對(duì)于未知序列必須構(gòu)建克隆后才能測(cè)序，難以實(shí)現(xiàn)基因組水平的大規(guī)模測(cè)序。

2. 測(cè)定堿基序列需要大量wan全相同的DNA拷貝。

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